实验四：纸层析法分离氨基酸

graph TD
    A[开始] --> B[层析滤纸准备]
    B --> C[点样]
    C --> D[展开]
    D --> E[显色]
    E --> F[计算Rf值]
    F --> G[结束]

    %% 步骤注释
    B -->|仪器：铅笔、尺子<br>操作：标记M/O/N点| B
    C -->|关键：毛细管点样，斑点直径≤3mm| C
    D -->|试剂：正丁醇-醋酸-水展开剂<br>注意：原点不可浸入液面| D
    E -->|显色剂：茚三酮丙酮溶液<br>加热温度≤60℃| E
    F -->|公式：Rf=a/b| F

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实验步骤与仪器试剂清单

步骤	操作内容	仪器	试剂/材料
1. 层析滤纸准备	在滤纸距一端2cm处划起点线，标记M、O、N三点，距边缘≥1cm	层析滤纸（9cm×20cm）、铅笔、尺子	无
2. 点样	用毛细管依次点样：O点（混合液）、M点（丙氨酸）、N点（亮氨酸），每点重复2次，风干后斑点直径≤3mm	毛细管（1mm）、氨基酸混合液、0.2%丙氨酸乙醇溶液、0.2%亮氨酸乙醇溶液、电吹风	氨基酸溶液、混合液
3. 展开	层析缸注入展开剂，悬挂滤纸使原点线浸入液面下1cm，密闭展开至溶剂前沿距顶端3-4cm	标本缸（10cm×30cm）、展开剂（正丁醇:醋酸:水=4:1:5）、细绳/铁丝固定滤纸、计时器	展开剂
4. 显色	取出滤纸标记溶剂前沿，喷洒1%茚三酮丙酮溶液，电吹风加热至紫色斑点显现	喷雾器、电吹风、铅笔	1%茚三酮丙酮溶液
5. 计算Rf值	测量斑点中心与原点距离（a）、溶剂前沿与原点距离（b），计算$R_f = \frac{a}{b}$	尺子	无

图 3-3-1 纸层析示意图
A 纸层析装置 B 纸层析滤纸条

层析缸 2. 滤纸 3. 展开剂 4. 丙氨酸斑点 5. 亮氨酸斑点

关键原理与注意事项

层析原理 ：

分配系数差异 ：氨基酸在固定相（滤纸吸附水）与流动相（有机展开剂）中的溶解度不同导致迁移速率差异。
Rf值计算 ：极性小的氨基酸（如亮氨酸）在展开剂中溶解度更高，Rf值较大；极性大的丙氨酸Rf值较小。

操作优化 ：

点样技巧 ：毛细管需垂直轻触滤纸，避免扩散过大（直径≤3mm）。若样品浓度低，可重复点样3-4次。
展开控制 ：层析缸需密闭以饱和蒸气，展开时间约20-40分钟，溶剂前沿上升速度约1cm/10分钟。

显色条件 ：

茚三酮与α-氨基酸反应生成紫色化合物（脯氨酸显黄色），加热温度过高会导致斑点模糊或碳化。

仪器试剂替代方案

层析缸替代 ：可用大试管或烧杯+保鲜膜密封代替。
喷雾器替代 ：滴管均匀滴加显色剂（需覆盖整个滤纸）。
展开剂调整 ：若分离效果差，可调整正丁醇:醋酸:水比例为3:1:1或5:1:4。

思考题参考

Rf值意义 ：反映化合物在固定相与流动相中的分配比例，受温度、滤纸类型、溶剂系统影响。
极性判断 ：亮氨酸Rf值＞丙氨酸，说明亮氨酸极性更小（疏水性更强），丙氨酸极性更大（亲水性更强）。

更多细节可参考《分析化学实验技术手册》或生物化学层析技术指南。